O tétano continua sendo um grave problema de saúde pública no Brasil, com média de 294 casos por ano. A doença por infecção pelo bacilo do tétano pode ser doença imunoprevenível por meio da vacina e do soro antitetânico (SAT). Antes de os imunobiológicos serem disponibilizados à população, são necessários testes de controle de qualidade nos lotes para verificar sua segurança e eficácia. No Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), os ensaios de potência são realizados como um dos testes farmacopéicos para avaliar a eficácia dos Soros Antitetânicos (SAT), exigindo um grande número de animais de laboratório no Teste de Neutralização de Toxinas (TNT). O objetivo deste estudo foi validar o teste de inibição da ligação de toxinas (ToBI) para substituir o TNT aplicado ao SAT. Os resultados encontrados indicam que o método proposto possui linearidade, especificidade e precisão satisfatórias, sendo um teste confiável e rápido, apresentando um bom desempenho em substituição à metodologia in vivo. O uso do método alternativo reduz drasticamente o uso de animais, o tempo de liberação de laudos e os custos de controle de qualidade do SAT.